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可诱导的CHO细胞系的分批补料培养策略评估
发布时间:2019-12-18 05:01

  为了使诱导型CHO细胞系的细胞生长和抗体产量达到最大化,研究了各种补料分批培养策略。通过评估在中等细胞密度和高细胞密度条件(4x106 and 10x106cells/mL)下的诱导性能,来评估诱导时间的影响。我们首先证明了早期补料的重要性,与后期补养相比IVCD和抗体浓度都有显著提高,然后我们通过动态补料速率维持不同水平的葡萄糖浓度(25, 35 and 50 mM)研究补料速率的影响,在中等浓度下抗体浓度达到最大,注意过低、过高补料的风险。然后我们通过不同的适当低温又考察了温度对其表现的影响。小规模培养时,当达到高细胞密度时将温度从37℃降至30℃,实现了最高产量1.2 g/L,该策略应用于生物反应器时,更好的控制条件使产物浓度达到了1.8 g/L。此外,该培养方案显示在细胞生长阶段保持34℃,在产物合成阶段保持30℃,能够促进半乳糖基聚糖的产生。

  过去的几十年中,动物细胞技术领域致力于提高重组蛋白产量并确保高产品一致性,表达系统和培养工艺的发展使得蛋白浓度通常超过5 g/L。据统计哺乳动物细胞产生的治疗性蛋白质约占药物市场的20%。由于对生物制药的需求不断增加,提高生产效率至关重要,而优化表达系统是提高重组蛋白生产水平的关键因素之一。

  近年来关于诱导哺乳动物CHO细胞表达系统生产充足蛋白的报道越来越多。虽然通常认为诱导系统是表达细胞毒性物质的理想选择,但也有利于区分生长阶段和生产阶段,方便分阶段优化。在不同的诱导型哺乳动物表达系统中,cumate基因开关系统获得了越来越多的关注,然而,过程条件和培养控制策略导致提高产量和产品品质还没有被这个系统和其他哺乳动物细胞表达系统所证明。

  补料分批培养仍然是最广泛使用的培养操作模式,特别是在工业规模上,与批式和灌流相比,它具有操作简便性和更高产量的特点,补料分批培养的基本原理在于定时或连续补充浓缩培养基防止营养不足。营养物质的添加量取决于其消耗率,而营养物质消耗率又与细胞的生长代谢关系密切。由于动物细胞代谢的复杂性以及对代谢调控的有限认识,培养策略通常是的建立在大量试验的基础上。补料方式直接影响细胞生长、产物合成和副产物生成,良好的补料策略不仅能够防止形成营养物质缺乏,还能减少副产物的积累。在众多的培养方案中,最为常见的还是补加浓缩培养基。这种方法虽然操作简单,但可能导致营养物浓度和渗透压的变化。另一方面,需要开发更加可控的动态培养策略,从而满足不断变化的细胞需求。某些策略是使主要营养物质保持在低水平来减少副产物积累,但是需要频繁取样并具有可靠的测量工具以形成控制循环。其他培养策略是通过测量氧摄取率、生物量或pH值以确定需要添加的营养物的量。

  环境物理化学参数如pH,溶解氧(DO)和温度对细胞生长、代谢和蛋白质合成具有显着影响。温度是一个重要的工艺参数,对其进行了详细的研究,许多过程为双相培养,在细胞初始生长阶段保持生理温度,在生产阶段进行降温,低温能够有效控制细胞增殖并在长时间内保持高活力,也有报道指出在亚低温条件下细胞比生产率更高。CHO细胞生产蛋白表达过程已经被详细报道

  由于对哺乳动物诱导细胞系的兴趣日益增加,需要开发对这些系统特异的优化培养条件,例如补料策略。本研究的目的是探索各种补料方式和温度变化对提高抗体生产力和确保产品质量的影响。诱导时间是诱导系统考虑的关键参数,从而实现细胞快速生长,延长培养寿命和提高生产力的目的。以前研究表明,细胞动力学会受到分批培养过程中诱导时的细胞密度的影响。出于这个原因,通过考虑诱导时的中等和高细胞密度来评估和比较本文提出的各种补料分批策略

  本研究中使用谷氨酰胺合成酶CHO细胞系,其允许利妥昔单抗(一种嵌合抗人CD20单克隆抗体)的cumate诱导表达。将细胞放在添加有50μM MSX的PowerCHO2培养基中。把含有50μM MSX和0.3%pluronic F68的BalanCD作为基础培养基。把在PowerCHO2中培养的细胞离心换液到BalanCD培养基,无需适应。培养基中加入添加有50uM MSX和0.3%kolliphor的IS CHO-CD F12.7。在基础和补料培养基中添加不同的表面活性剂,尤其是在高密度条件下可以减少细胞结团。补料分批培养时每天调节补料速率来维持的恒定葡萄糖水平。摇瓶实验则是接种密度为0.2×106 cells/mL,使用125mL的摇瓶,放置于5% CO2、所需温度的摇床中,覆盖层的潮湿培养箱中搅拌这些培养物。添加2μg/mL的cumate诱导剂,并在积累产物阶段将温度调节至所需值(37,34或30℃)。诱导后24小时添加0.05mg / mL硫酸葡聚糖。每天留样,上清置于-20℃用于后续分析。

  在使用Akta Explorer System(GE Healthcare,Baie-dUrfé,QC)通过蛋白A色谱法纯化蛋白前先过滤得到上清并混合到缓冲液中,进样前先以1.5mL / min的流速平衡蛋白A柱(ESHMUNO®,MiniChrom柱,Eshmuno®A,1mL,Merck),使用pH 4为20mM的甘氨酸缓冲液以相同的流速洗脱单抗,使用Millipore 的Amicon Ultra-4过滤装置进行缓冲液置换,最后将样品冻存在-20℃下用于后续检测;通过HILIC测定聚糖糖型组成,先通过PNGase F在37℃下24小时使浓缩样品变性,再用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记样品后注射到TSKgel Amide-80柱上,然后用pH为4.5的100mM甲酸铵(溶剂A)和100%乙腈(溶剂B)洗脱聚糖,对荧光色谱图的2-AB葡聚糖梯度校准,并与glycobase.nibrt.ie/glycobase/中的GU值进行比较,从2-AB标记的N-连接聚糖的峰面积确定糖型的相对含量。

  根据以下因素计算生长期间(从接种到诱导)和生产(从诱导到收获)阶段的平均细胞比率:

  其中Ci是营养物质或代谢物浓度,V是培养物体积,Vfeed是添加的补料培养基的体积,Ci,feed是补料培养基中营养物的浓度,t0是接种时间,tinduction是诱导时间,tharvest是收获时间。平均细胞比生产率在整个培养期间计算如下:

  在摇瓶中进行不同时间的补料实验来研究其对对细胞生长,代谢物形成和抗体产生的影响。评估了诱导前补料、诱导时补料和诱导后补料,所有摇瓶在诱导时将温度由37降至34℃,在没有添加cumate的培养基中分别培养至指数中期(4x106 cells/mL)和指数后期(10x106 cells/mL)进行诱导。图1为活细胞浓度和活率图。对于两者而言补料后细胞生长显着增强,指数中期和后期诱导最大细胞密度分别为13×106 cells/mL和14×106cells/ mL,指数中期诱导培养时间为16天,活率在80%以上持续14天,指数后期诱导活率在第10天开始下降,三种情况活率都降低了30-35%,但诱导前补料活率下降更晚。所以在指数中期诱导并且在此之前补料效果更好。如表1。

  营养素、代谢物和抗体浓度曲线所示。葡萄糖是基础培养基中碳和能量的主要来源,延迟补料导致葡萄糖浓度早期降低,第4天之前,乳酸浓度曲线mM。在指数中期诱导时,会伴随乳酸从产生到消耗的过程,而在指数后期诱导时已经完成了代谢的转换。乳酸代谢转换只是暂时的,因为所有实验组最终都表现出该乳酸的净产量(图2B)。此外,由于中等细胞密度培养持续时间较长,铵离子浓度比(5-6mM)高细胞密度诱导时的铵离子浓度(3至3.5mM)要高。在生长期(即诱导前),在指数中期相比后期细胞平均特葡萄糖摄取和乳酸生产速率均较高(表1)。在产物生产阶段,平均细胞比率通常降低,但是几种情况都非常相似。不管是在指数中期还是后期进行的诱导,最终的抗体浓度都表现为诱导前补料的含量显著更高,这种增加主要是因为上述增加的IVCC。生产率虽然略高,但没有统计学差异。

  图1 具有开始补料时间细胞密度(A和B)和细胞活率(C&D)曲线。诱导前补料(三角形)、诱导时补料(圆圈)和诱导后补料(正方形)分别对应24、96和120小时。实心符号表示以4×106cells/mL诱导,空心符号表示以10×106cells/ mL诱导。虚线表示诱导的时间,箭头表示开始补料。在诱导时温度从37°C变为34°C,误差棒表示标准偏差。

  图2 不同补料开始时间培养物中葡萄糖(A和B)和乳酸(C&D)图。诱导前补料(三角形)、诱导时补料(圆圈)和诱导后补料(正方形)分别对应24、96和120小时。最终氨(E)和抗体(F)浓度。实心符号表示以4×106 cells/mL诱导,空心符号表示以10×106 cells/ mL诱导。虚线表示诱导的时间,箭头表示开始补料。在诱导时温度从37°C变为34°C,误差棒表示标准偏差。*表示p0.05,**表示p 0.005。

  为了研究营养素是否会影响细胞生长和最终抗体浓度,进行另一组摇瓶实验。动态补料维持葡萄糖浓度为25mM、35mM和50mM,产物积累阶段温度从37降至34℃。结果如图3所示。细胞浓度曲线mM时细胞生长和产物产量最低,其最终mAb浓度与使用相同培养基进行的批式培养类似。因为葡萄糖浓度在最初的7天中仅在开始培养时较高,期间葡萄糖浓度都很低(图3B)。

  对于中等和高细胞密度下诱导的培养物,在葡萄糖设定为35mM下达到最大终产物浓度1.05 g/L,产物产率比用最高葡萄糖培养高约1.4倍。因为葡萄糖浓度过高会导致活细胞密度和产物浓度显著降低,所以不宜采用50mM的葡萄糖。培养时间对最终抗体浓度起着决定性作用,虽然中、高浓度葡萄糖下细胞的比生产率类似,但是后者培养时间则仅为15天。

  代谢物如图3所示。所有条件下乳酸都表现为在指数生长期内快速积累。在以高糖浓度培养期间,在第5天乳酸浓度达到15mM,在4-5天是其他糖浓度条件下的1.5倍,特别还是在稀释率最高的情况下达到的这一水平。不管是在细胞生长和产物生产阶段,在高糖浓度条件下细胞的糖耗和乳酸产生率显著更高(表2)。产物生产阶段的速率降低与补料速率无关,很可能是由于诱导时温度降低导致的细胞代谢减慢的结果。

  图3 不同进料速率活细胞(A),累积补料体积(B),葡萄糖(C),乳酸(D),最终铵离子浓度(E)和最终抗体浓度(F)。在低(圆圈),中间(三角形)和高(正方形)补料速率对应的葡萄糖浓度分别为25mM、35mM和50mM。实心符号表示以4×106 cells/mL诱导,空心符号表示以10×106 cells/ mL诱导。虚线表示诱导的时间,箭头表示开始补料。在诱导时温度从37°C变为34°C,误差棒表示标准偏差。*表示p0.05,**表示p 0.005。

  为了确定诱导后温度是如何影响细胞生长和产物浓度的,分别进行了批式培养和补料分批培养(图4)。补料分批培养从第一天开始保持葡萄糖浓度为35mM,评估在指数中期(4×106 cells/mL)、指数后期(10×106 cells/mL)诱导对其的影响。在批式培养中,不管生长阶段温度时37还是34℃,当温度降至30℃时IVCD都有所改善(图4A),同时最终抗体浓度趋势也是类似(图4B)。由于温度降为30℃延长了培养时间,最大抗体浓度相较于37℃提高了3倍,达550~600mg/L,大多数的批式培养细胞比生产率均在6-8 pg/cell.d,而在37℃下仅为3-4pg/cell.d。

  在补料分批培养试验中,相同的温度条件下,4×106 cells/mL和10×106 cells/ mL时诱导具有很大的差异。在高细胞密度下诱导时,不考虑细胞生长期间的变化,只在产物生产阶段将温度降为亚低温而导致IVCD和最终抗体浓度的增加,与不改变温度相比,IVCC至少改进1.5至2倍,达到的最大抗体浓度高1.7~2.4倍(1.2g/L)。在细胞生长阶段保持37℃,产物生产阶段降温至30℃表现最优。

  在中等细胞密度诱导时,亚低温对IVCC和抗体是有促进作用的。当温度从37℃切换到34℃时,获得了最大IVCC和产物收率。细胞生长阶段保持温度在34℃并没有比37℃更优,但是对于两种诱导条件,在产物生产阶段将温度降至30℃能够提高细胞比生长率(表3)。分批补料培养中的细胞密度,细胞活力,葡萄糖和乳酸数据如图S2和S3。

  在没有降温的情况下乳酸呈现一直上升的趋势,然而在其他条件下乳酸也不总是随着温度的转化而出现代谢的转变,尤其是在高细胞密度下诱导时,在诱导前就出现了代谢的转变然后再进行的降温。

  细胞生长阶段37℃更有利于细胞生长和葡萄糖消耗(表3),产物生产阶段代谢变慢,即便没有降温也是如此。

  图4 在诱导中不同温度变化的批式培养(A&C)和补料分批培养(B&D)活细胞密度和抗体浓度。灰色实心符号表示以4×106 cells/mL诱导,黑色表示以10×106 cells/ mL诱导代表以4×10 6个细胞/ mL诱导的培养物,误差棒表示标准偏差。*表示p0.05,**表示p 0.005。

  在2L的生物反应器中进行两个补料分批培养,基于摇瓶实验结果,两个生物反应器分别在37、34℃开始。细胞密度达到10×106 cells/mL后进行诱导并将温度降至30℃,37℃和34℃最大细胞密度分别为14×106 cells/mL和12×106 cells/mL,平均细胞比生长速率在37℃和34℃时分别为0.6d-1和0.5d-1,所以37℃时第五天诱导,34℃时第六天诱导(图5A)。

  两种条件活率在17天内都超过90%,温度降至30℃后生长减缓,初始温度为34℃的迅速进入平台期。37℃的则继续生长。第一个生物反应器(37-30)中达到最高抗体浓度(1.8g/L)比第二个反应器(34-30℃)1.5倍,主要归因于IVCD的显著增加(表4)。生物反应器中的最高产物浓度比摇瓶高1.5倍,生物反应器中的细胞比生产率高可能是由于更好条件控制。

  37-30℃条件下从开始培养到第四天乳酸浓度逐渐达到22mM,之后乳酸开始消耗,在收获时为4 mM。34-30℃条件下乳酸浓度较低,第5天时为15mM,之后稳定增加,在结束时转为消耗。生物反应器与摇瓶中后期的乳酸消耗形成鲜明对比(图3D,图2D)。铵离子浓度在两种温度条件下最终浓度为2mM,相比于摇瓶铵离子的比生产率较低(表3)。

  图5 细胞生长阶段诱导前在37℃(实心)和34℃(空心)条件下在生物反应器中的补料分批培养中活细胞(A),抗体(B),葡萄糖(C)和乳酸(D)浓度曲线 cells/mL密度的诱导时间,诱导时温度降至30℃。误差棒表示标准偏差。

  糖基化是影响抗体功能的关键因素,识别聚糖分布参数已经成为生物制药业的共识。因为温度能够影响细胞代谢、蛋白质表达率和培养时间,所以其可以作为影响影响糖基化的工艺参数之一。我们虽然已经分析了生长阶段在不同温度下操作两种生物反应器产物的聚糖分布,但是为了获得关于聚糖分布的时间规律,37-30℃条件下在第11、14天收集样品,34-30℃条件下在第10、13天收集样品。两次采样分别对应活率为95%和60%。通过HILIC分析得到的聚糖分布如图6所示,结果表明,在细胞生长阶段生理温度培养,不管是在高或低细胞密度条件下,细胞产生的半乳糖基化,唾液酸化和岩藻糖基化的百分比略高(表5),但无统计学意义(p0.05)。从图6中还可以看出,培养持续时间对糖基化具有影响,因为在细胞活力降低的条件下,在培养物收获时,无乳糖分解的聚糖部分更高,34-30℃培养条件下,聚糖分布随时间的变化小得多。

  图6 补料分批发酵高细胞密度条件下诱导的聚糖分布。样品在高活率时(37-30培养物为11dpi,34-30培养物为10dpi)和收获时(37-30培养物为14dpi,34-30培养物为13dpi)收集,误差棒表示标准偏差。

  本论文研究了不同补料分批培养策略对CHO细胞系产生抗体能力的影响,诱导表达系统增加了实验的灵活性,可以在细胞生长和抗体生产阶段设置特定的条件。将细胞快速培养至所需密度,然后添加适当的诱导剂来触发目的蛋白质的产生,之前的工作证明了诱导时间对整个过程的重要性,在批式培养中发现诱导时增加细胞密度会降低细胞比生产率,这可能是由于关键营养素的限制,这与最高细胞密度和最大细胞生产力相矛盾。全国十大赌博官网!为了克服批式培养中遇到的瓶颈,探索补料分批培养模式来进一步提高抗体产量。本研究中在中等和高细胞密度条件下进行诱导,以突出在批式培养中遇到的类似限制,同样也考虑到了诱导时间对培养策略的影响。本研究的目的是确定最合适的补料分批培养策略和诱导时间的组合,以获得最高的产品浓度,并确保高的产品质量。

  任何补料分批培养策略的目标都是使IVCD和抗体生产速度达到最大,最终表现为产物浓度的增加,由于操作简单,这种培养模式仍然在工业生产中最常见。补料分批培养中的最重要的问题是“什么”“什么时候”“多少”,什么即培养基的组成是什么,根据细胞特定的要求合理设定补料方案,本研究在摇瓶阶段筛选出了合适的商业培养基(数据未显示)。

  但是商业培养基的配方都是保密的,葡萄糖和谷氨酰胺通常是细胞培养基/饲料中存在的主要碳和能量来源。本研究使用的细胞系含有谷氨酰胺合成酶系统,可以在不含谷氨酰胺的培养基中生长,减少氨的积累并能够延长补料分批操作,因此所有补料操作都是以葡萄糖浓度作为补料的基准。

  什么时候是指补料的时间。本研究测试了相对于诱导时刻建立的三种补料开始时间。与仅在抗体生产阶段期补料相比,从开始培养时添加浓缩的营养液是有益的,特别是在中等细胞密度诱导的情况下更为突出。推断是因为浓缩的营养素促进了细胞的生长,避免了营养条件的限制,并且早期补料对结束时的高乳酸和铵离子是没有关系的。

  应该着重研究补料分批培养中补多少的问题,防止理化环境发生较大改变和抑制性代谢产物的生成,防止浓度过高对细胞产生毒性。在诱导前的高补料对细胞生长没有负面影响,但是也没有很好的表现,而在适当的补料策略下,获得了最高的活细胞密度和培养持续时间,并且在两种诱导条件下都表现出了最高的抗体浓度。但是没有测量补料培养基的渗透压,推测高渗可能会抑制细胞生长和蛋白质合成。当补入商业浓缩液时,也会同时加入生长因子,激素,盐,维生素和氨基酸等物质,这些可能不是所有细胞都需要的,或者它们可能需要的水平比提供的水平低得多,许多成分,如维生素和矿物质,即使浓度比细胞要求高一到两个数量级也是无毒的,然而高浓度的某些氨基酸可能会抑制细胞的生长和产物的合成。由于我们使用的浓缩液中的氨基酸组成并未针对我们的细胞系进行特别优化,因此适当的补料方式提供了更均衡的营养素,有利于延长培养时间。

  分批补料培养中最大的挑战是抑制副产物的积累。乳酸是葡萄糖代谢的主要副代谢物,其会一直细胞的生长和蛋白的产生。在本研究中,CHO细胞在20~55mM的葡萄糖范围内培养,达到的最大乳酸浓度均在12mM~22mM之间,远低于报道的对CHO细胞生长抑制的水平(40~60mM)。此外,许多研究表明乳酸代谢转换与CHO细胞重组蛋白的生产力呈正相关。多数实验表明,在培养的前4天乳酸逐渐积累,之后出现暂时消耗。摇瓶实验表明乳酸在培养结束时会再次积累,而反应器则是消耗,这可能是由于反应器的pH控制较好。高浓度铵离子(5mM)会抑制细胞生长并降低抗体的比生产率,我们采用GS工程细胞系,可以从铵和谷氨酸产生谷氨酰胺,从而有助于减少铵的积累。

  保持高活力是提高哺乳动物细胞产量的有效方法。因此,常见的优化方法是将细胞培养至中等细胞密度,然后通过降低温度或pH诱导从而延长稳定期。因为温度对细胞周期,细胞凋亡,代谢和蛋白质合成的复杂影响,所以最常通过双相过程策略优化培养过程,因此,我们研究摇瓶和反应器中温度变化对细胞生长和抗体合成的影响。不管是在高还是中等细胞密度时进行诱导,将温度从37℃降至34℃或30℃对抗体产率是有益的,抗体产量的提高不仅是因为延长了培养时间,还与细胞的比生产率的提高有相,在组成型表达的情况下,已经探讨了温度和细胞生长之间的关系。温度降低还会提高CHO细胞特异性表达,例如在EPO,t-PA和TNFR-Fc的情况下,几个与核糖体和蛋白质翻译的基因在G1期高度表达。温度降低还会导致细胞代谢的总体减缓,葡萄糖和氨基酸摄取速率的降低会导致乳酸和铵离子产量的降低,这可能在一定程度上延长了培养时间和高的细胞活力。

  糖基化模式能够影响抗体的功能。在以利妥昔为产物的情况下,半乳糖基化与CDC活性相关,因为末端半乳糖残基可与补体C1q结合,利妥昔的去半乳糖基化会使CDC活性降低一半。在生物制药方面提高抗体的半乳糖基化水平将会有利于细胞培养。

  宿主细胞系、培养基配方和工艺条件都会影响抗体的糖基化形式并且有报道指出pH、副产物和营养限制都会直接影响蛋白质质量,关于温度对CHO细胞培养糖型的影响也有大量的研究。在不同温度的实验中发现32℃时能够促进EPO生产并保持较好的产品质量,温度降至30℃及以下则会对糖基化产生负面影响。本研究分析了37~30℃和34~30℃两种抗体产量最高的糖基化分布,在细胞生长阶段较高的温度导致最初略高的半乳糖基化,但是单半乳糖基化和二半乳糖基化越来越少,在两个生物反应器条件下,收获时的糖基化分布相似。

  由于蛋白酶和糖苷酶的释放可能会改变糖基化谱,特别是当培养结束细胞活力低时。亚低温条件能够降低酶活性,维持细胞的高活力。还有报道指出低浓度的铵离子会对糖基化产生负面作用。我们的生物反应器中最终铵离子水平仅约2mM,因此不太可能成为主要因素。降低温度来降低唾液酸含量,本研究在细胞生长阶段与温度没有显著性关系,并且唾液酸化含量也与细胞活力的变化无关,所有分析的样品中唾液酸化水平都很低。

  为了使抗体产量最大化,需要开发出高细胞比生产率并保持长时间高活率的补料分批培养工艺。利用诱导型细胞系在双相培养的情况下,诱导的时间是确定工艺的关键参数。我们研究了补料方式、诱导时的细胞密度和降温策略的影响,证明了早期(即诱导前)补料效果最好,还要使补料速率与细胞生长和产物生产平衡化,在抗体生产阶段降低温度能够提高生产效率。可以通过连续培养的方式进一步提高诱导时的细胞密度,但是培养过程的产率和稳定性还有待评估。